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细胞系毛病审定:闭幕的最先
工夫:2015-12-15 泉源:www.hybribio.cn 阅读:26329
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2010年5月ATCC SDO(Standards Development Organization)工作组正在Nature review cancer杂志上宣布了题为《Cell line misidentification:the beginning of the end》前瞻性报导。以下是全文内容。

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细胞系作为一般或肿瘤构造的形式细胞被普遍应用于科学研究和药物开辟,但是很大一部分的细胞系被毛病符号或被别的个别、构造、种系泉源的细胞所替换,因为科学界没法处理此类题目致使大量果运用毛病审定的细胞系而致使误导或存在潜伏毛病的学术论文宣布。经由过程近年来的勤奋而开辟出的STR分型要领已成为对人源细胞停止审定的尺度要领,STR分型的运用成为革除细胞毛病审定那一题目的主要一步。

细胞系作为体外模子而被普遍应用于生物医学研讨。准确数据的得到经常依赖于细胞系的特性,尤其是当它用来替换其泉源者的构造时。使人感应惊奇的是,细胞毛病审定的发生率却不低,致使本来把某一细胞归为另外一细胞系的泉源者一般都是毛病的?。细胞毛病审定题目已有50年历史,基于国际细胞库的剖析数据显现:1977年细胞毛病审定率为16%,1999年为18%,直到最近几年,应用于生物医学范畴的细胞系需求审定的题目仍旧很少有人存眷。因而ATCC尺度开辟构造工作组ASN-0002(SDO,一个现在正在开辟人类细胞系审定尺度的工作组)成员写了那篇科学取社会文章。ATCC SDO成立于2007,旨在开辟最好的应用于生命科学的尺度,及运用同等的工序去均衡工业界、当局、和谐部门和学术界的看法。我们希冀此尺度草案可以或许正在2010年获得民众的检察和批评,随后,终究草案被美国国家标准研究院(ANSL)核准。

这里我们形貌了细胞毛病审定构成的缘由、给科学界带来的影响和汗青、,和为处理此题目所做的勤奋。我们议论了现在能用于细胞审定的差别要领并推荐运用STR分型来审定人类细胞系。大概由于其重要性,一个通用的STR分型数据库正在建立傍边。

细胞毛病审定的发明

人类和植物细胞培养物的毛病审定是一个临时的题目,最后意识到此题目可追溯到上世纪50年月。核型剖析和免疫学要领最早被应用于细胞审定,当大量的种系毛病审定被报导后,促使ATCC正在1962年竖立细胞系审定库。

种内的细胞正在1962年借不克不及判别,到1966年Stanley Gartler引入生化多态性的观点去对人类细胞停止判别(基于同工酶的表达)。1966年,正在关于细胞、构造及器官造就的第二个十年回忆会议上,Gartler报导了如许一个征象:据推想来源于18个自力个别的细胞系却全是Hela细胞(Hela细胞为人类第一个被竖立的细胞系),比方包孕来源于一般肠上皮细胞(Int-407)、一般羊膜细胞(WISH)、一般肝细胞(Chang liver)、喉癌(Hep-2)和口腔癌(KB)。Hela细胞来源于一名名叫Henrietta Lacks的宫颈腺癌患者,因为Hela细胞享有特殊的职位以是它被分配至世界各地,盛行于各实验室之间。因而,直到现在,很多科学家都还未发觉到Hela细胞存在与其它细胞发作交织净化的可能性。Hela细胞详细极强和快速的发展才能,因为发展过快致使它会很快抑止别的细胞的发展。

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关于Gartler的发明,一些人以至那些应当晓得更多的科学家们皆表现出了抵抗和敌对的立场,然则有一名科学家Walter Nelson-Rees,对Gartler的话引发了稀奇注重。Nelson-Rees承包了一家从属于国度肿瘤研究院的细胞库,他取同事们开辟出一种应用核型剖析去对细胞停止审定的要领,他正在一系列宣布的文章中指出:正在收至细胞库的造就物中,据称为一个奇特的细胞培养物内里却存在大量的交织净化,Nelson-Rees的事情注解,由Hela细胞引发的交织净化极其广泛,以至经由多年后所有的细胞系皆能够被疑心是Hela细胞,除非能够证实它不是。Nelson-Rees不只正在科学文献中提出需求注重交织净化题目,他借经由过程信函关照受此题目影响的科学家。Nelson-Rees对细胞审定最初的孝敬于2009年宣布(死后不久)。

当Nelson-Rees第一次宣布他的发现时,一些科学家基础不予理会以至否定他的证据,并继承宣布包罗错误信息的学术论文。效果,Nelson-Rees正在念不出任何设施下只得对运用了净化细胞系的论文或小我私家停止了标注。正在谁人时期(或许今天),Nelson-Rees的行动被以为黑白科学的,他遭到了很多同寅的进击。他将本身标榜为治安保持会会员,1981年,NIH停止了取他的条约。自从那以后,细胞毛病审定征象愈演愈烈,题目逐渐扩大。接下来的10至20年内,细胞库分发了很多毛病定名的细胞。

评价由交织净化或细胞毛病审定而发生若干误导性和毛病的研讨是难题的。从1969到2004年,毛病审定造就物的运用正在PubMed数据库中增添了约莫10倍,而运用造就细胞宣布的论文仅增添了2-2.5倍。到2004年,Hela细胞只是冰山一角,很多其他细胞系正在差别“外套的假装”下流行于世界各地实验室。

一项针对正在处置细胞培养的工作人员观察显现:483例被调查者中,32%运用了Hela细胞,9%的人正在不知情下运用了Hela污染物,只要33%的观察者对他们运用的细胞停止了审定。35%的人得到细胞的路子是其他实验室,而不是大的细胞库。

正在已往的凌驾50年的工夫,关于细胞毛病审定题目,只管有人会趾高气扬,并正在一些状况下人们最后的回响反映为否认,但仍有一小部分的人致力于弥补此题目。正在小我私家勤奋中个中占大部分的是相干职员写信给编纂要求审稿人注重细胞毛病审定题目,和要求作者供应证据以证实正在研讨中运用的细胞系既没有交织净化也不是毛病审定的细胞。但这些勤奋正在Nelson-Rees的条约停止后大部分皆被无视了,只管事先DNA指纹识别手艺的泛起带来了新的和更多再生的要领,那一手艺正在90年月早期频频展现了细胞毛病审定的水平。

2004年,Roland Nardone最先了第二次的革新活动,他得到了厥后成为ATCC 尺度制订构造副主席的Joseph B. Perrone的支撑,Joseph B. Perrone不只为他供应了很多的主张,而且借供应了引发那场革新活动的所需求的义愤。与其他相干的科学家一同,Nardone提出了一个周全而互相和谐的建议,以同时追求引发对此题目素质和重要性的认识和恳求受此题目影响的构造和小我私家的到场,这些构造包孕NIH,Howard Hughes医学院。

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交织净化和毛病审定已有一段很少的汗青,那个中有很多的案例,我们很难去判定哪一个是最重要及价值最高的。

已被形貌的典范案例是Hela细胞净化(关于Hela细胞净化有好几个案例),使人惊异的是,很多被Hela细胞净化的细胞系竟然正在一些备受尊重的杂志上仍被运用,而那一运用间隔它们最早发明为Hela细胞的工夫长达40年之暂。

T24是别的一种发展快速的细胞系,它经常净化很多经推想来源于差别膀胱癌的细胞系。EVC304最早被以为是自觉转化的人类一般内皮细胞系,但厥后却发明它是T24膀胱癌细胞系。使人感应不测的是,EVC304不是内皮细胞的那一叙述对它作为内皮细胞模子的公然宣布险些出多大影响。

推想来源于人类的前列腺癌细胞系TSU-Pr1和JCA-1也是来源于T24膀胱癌细胞系。这些研讨宣布正在杂志Cancer Research上,但它其实不能阻挠厥后一篇TSU-Pr1作为前列腺癌细胞系模子的研讨论文宣布正在Cancer Research上。

DNA指纹剖析展现NCI/ADR-RES细胞系实际上为卵巢肿瘤细胞系OVCAR-8,而不是乳癌细胞系。约莫有300篇已宣布的论文运用了毛病审定的NCI/ADR-RES细胞系。NCI/ADR-RES包罗正在NCI60细胞,二者STR分型雷同。

1篇形貌食管细胞系毛病审定的论文声称:基于这些被净化的细胞而发生的实行效果致使继承的临床试验需招募EAC(食管腺癌)病人,和需获得凌驾100多个刊物和最少三个NIH肿瘤研究所的认可,借牵扯到11个US专利。

长达50年的压抑,为何?

这里有三大群体需对细胞毛病审定卖力:科学家小我私家、科学期刊、资金管理部门。正在已往50年大部分工夫里,只要科学家个别对此题目提出了抗议。但是要念挣脱很多科学家居心悍然运用毛病审定的细胞系那一结论是很难的,再者,作者一般会很不宁愿宣布一项基于运用毛病审定细胞的声明。

John Maddox,Nature杂志的编纂,正在1980年针对有目共睹的交织净化问题写了一篇批评,题目为“科研工作需为诚信卖力”。只管他对此题目险些完整缺少洞察力,但他提出发起:没有来由疑心尽人皆知的少数几个案例在任何意义上只是交织净化题目的冰山一角。正在雷同的批评里,一些科学家们像Nelson-Rees蒙受中伤,由于这篇文章指出:若是这些文化行动(即科研中的诚信题目)遭到自夸为治安团成员的损坏,那么它将成为一场灾害。细胞系交织净化的汗青表示诚信其实不像很多科学家们期望信赖的它适用于世界各地科学界的那样。

与此题目相干的科学杂志编纂的回应继承络续天获得启示。数百篇科学杂志文章形貌了细胞毛病审定的事例,但直到如今,科学杂志或资金管理部门还没有接纳革除此题目的举动。

一个很有影响力的组织培养期刊的编纂被约请思索将细胞审定作为宣布论文的必要条件,但他回应道:那将是财务自尽。别的期刊的编纂也谢绝思索这一质控计划,他们以为一旦引进那一宣布论文的停滞,那些有志愿投稿至他们杂志的作者人数将会大大削减。

正在已往的两年里,立场最先发作改动,一些期刊如In Vitro Cellular and Developmental Biology、International Journal of Cancer、Cell Biochemistry 和Biophysics and the American Association for Cancer Research(AACR) journals要求细胞系正在宣布前需做审定。Nature杂志指出:起首基金组织必需要求细胞停止审定并提供需要的资金。一旦他们如许做了,Nature将会正在文章宣布之前要求细胞审定。与此同时,基金组织继承对此题目置之度外。

基金组织是保持科学尺度最有权利的部门,但使人惊异的是,他们谢绝思索处置惩罚以至不认可细胞毛病审定题目。比方,NIH宣布于2007年的公告无视了科学家个别和审稿人未能处理细胞毛病审定那一题目。一名Nature编纂指出:那一通告只不过让人自愿接管那一近况。

一些科学家小我私家实验去处理那一题目,但却遭受来自基金部门不予资助的回应,他们要末趋于否定要末将题目弱化。来自Cancer Research UK的一名资深科学家近来的一项声明提出:细胞毛病审定题目每一年皆有仰面。基金局部好像已遭到这个问题的要挟并对试图处理那一题目的科学家们加以反抗,别的基金局部对那些试图寻觅解决方案的科学家予以责难和使他们损失信用。

任何正在美国或英国的支撑生物医学研讨的重要基金部门本应正在已往的10年内里革除细胞系毛病审定题目,而革除那一题目所需经费要少于科学取社会所宣布的基金部门提供给每项目的均匀经费。但是,这些基金部门一次又一次天疏忽,或是正在某些状况下压抑有关那一题目的争辩,而且继承为运用毛病细胞的研讨项目供应赞助。有关基金部门对科学停止曲解和诈骗掌握那一脚色能够存在更大的连累。

关于细胞系毛病审定题目不管是期刊照样基金部门都应是没法容忍的。有迹象注解,Nardone的“诛讨”活动正在络续天得到影响力,而且人类细胞系审定的尺度将会成为Nardone遗产中一个明白的证据。

细胞毛病审定的泉源

大部分的细胞系正在学术情况中被竖立,正在学术情况下,组织培养一般被以为是一种对妙技少有要求的手艺,其所用到的需要装备如活动柜和孵育箱运用起来没什么限定。正在这些状况下,实验竖立一种新的细胞系一般会致使交织净化是不足为怪的。正在收至德国的微生物和细胞培养珍藏所的550个个白血病和淋巴瘤细胞系中,59/395(15%)被始创者送来的细胞系和23/155(15%)的二级泉源是毛病的。能够推想大部分二级泉源的细胞系已被交织净化或被始创者毛病审定。

有很多启事能够引发细胞培养物毛病审定,每个实验室皆存在风险。大概细胞毛病审定最间接的缘由就是正在通例操作过程中对细胞培养容器停止了毛病符号。形成这类题目泛起的缘由有:实验员的事情负荷、缺少注重和正在细胞操作过程中的专心。

造就物的交织净化和随后净化细胞的过量发展是另一个引发细胞系毛病审定的常见缘由。这种情况发作的几率正在以下前提会增添:试剂的共用、正在再豢养操纵时重复运用雷同的试管、正在没有充裕星散每细胞范例状况下同时对多个造就物停止操纵。当交织净化发作时,一种细胞范例敏捷发展而凌驾另一种,正在4-5次细胞传代后,一个纯的净化细胞培养物将会构成。

正在运用别的物种的滋养层(比方小鼠3T3细胞)去滋生人类干细胞或原始细胞时有意天共造就会致使交织净化或人类细胞系过发展。一般状况下,滋养层细胞处于无增殖状况,但只要发展抑止顺序不完全,它便会络续滋生并逐渐庖代人类细胞。体细胞杂交虽不常见但也会发作,如人类套细胞淋巴瘤细胞系NCEB-1便照顾了小鼠的七条染色体。

同种移植也会致使细胞系交织净化和毛病审定,来自同种移植的苏醒细胞会被宿主植物细胞所替换。

一般而言,交织净化终究的效果将会是少许顺应细胞完整且快速的替换。两个细胞系不克不及连续共存于同一个造就情况,除非它们是共生干系,但这种情况据我们所知借未有报导。一个细胞群经由很多次传代后还能包罗一个稳固的混淆基因组,唯一已知的状况是继续的体细胞杂交。

简朴、经济的量控步伐可以或许阻挠或最少会削减细胞毛病审定的发作。因为缺少正视及已接纳量控步伐致使细胞毛病审定征象极为广泛。大量量控步伐的执行和响应文件的恰当调解被以为是生物制药范畴泛起相对较低细胞毛病审定报导的身分。

交织净化检测

很多要领已被用来检测交织净化,包孕同工酶剖析、核型剖析、人类白细胞抗原(HLA)分型,免疫分型和DNA指纹识别。这些要领皆能够判别出某一种细胞系,然则区分才能各不一样。但是,这些要领正在差别实验室所得到的数据却不尽雷同,致使没有任何一种要领能够用来竖立一个尺度参考数据库。

很多实验室应用STR分型来鉴定人源细胞系。STR分型是一种用来做亲缘剖析的要领,它的道理是正在一单管中同时扩增多个多态性DNA片断。STR位点是由差别数量反复单位构成的反复DNA序列。每个STR位点均能被扩增且扩增产品符号上不同颜色的荧光,使得扩增产品很容易经由过程片断巨细和色彩去辨别。STR分型快速、经济、易于自动化,能获得可反复的数据,且数据格式合适竖立一个尺度参考数据库。因为快速、审定的细胞系效果明白,STR分型的运用代价最大。

STR分型——潜力及范围

3-5个碱基反复的DNA反复序列已通例性天用来做亲缘审定、法医鉴定、和审定正在20年之前的大灾难中罹难的受害者。随后,STR分型用于细胞审定中。用STR分型来做细胞审定有几大上风。

肿瘤细胞系包罗很多遗传改动,因而用STR分型来剖析肿瘤细胞系的尺度必需取一般构造纷歧(睹增补信息Box3)。肿瘤细胞一般会表现出杂合性丧失(即缺失一个等位基因致使难以取纯合子相辨别),别的因为DNA复制,肿瘤细胞可照顾等位基因的多个拷贝。与此相似,正在肿瘤细胞培养历程中,肿瘤细胞系既可落空等位基因的一个拷贝,也可偶然得到一个拷贝。以是,雷同细胞系的亚系可能会含有差别的STR分型。

对照雷同的等位基因,过去宣布的数据注解,75%的一致性已能判别出所有已知的交织净化细胞系,一致性凌驾50%的两个细胞系不会以为是来源于差别个别,因而,正在单一细胞系和存在交织净化的细胞系之间存在25%的“缓冲区”,任何细胞系只要一致性程度正在50%和75%之间,它便应当以为是可疑的。

正在剖析人类细胞系基因型中,其重要的题目包孕纯合子峰高不平衡(即一等位基因的峰高或面积宏大于另外一等位基因)、某一基因座泛起多个等位基因、等位基因丧失(目标片断未能扩增)。因为肿瘤细胞系为非整倍体,所以其纯合子峰高不平衡和正在一个或多个基因座泛起多个等位基因的征象异常典范。

基因分型所需用度是人人重要体贴的题目,然则相对细胞系的全部事情来说其用度便微乎其微了。STR分型的用度包孕DNA提取、STR 位点的PCR扩增、毛细管电泳星散扩增片断和数据剖析。增添STR基因座的数量如从6个到15个将会到达一个异常下的分辨率。

STR分型存在一个大的范围,就是它不克不及检测来源于其他物种的净化细胞,哪怕是人类细胞被过发展的别的物种细胞所掩盖,用人类或高档灵长类特异性引物也不会有DNA扩增。正在PCR中采用用物种特异性引物能够用来检测来源于别的物种的净化细胞。若是应用于别的物种的STR分型已被竖立(现在局限于少数几个具有主要商业价值的物种),STR分型无疑可被用来审定净化细胞。

关于大部分已被竖立的细胞系,供体构造已不克不及得到,那些被普遍运用的细胞系其最后泉源者要末退休要末已谢世。正在这些状况下,一种基于贮存于细胞库中能够是最老的细胞群设想泛起了。这些分型将需求符号上“暂时”去指导缺少对最后供体构造的分型审定。

鄙人里形貌的数据库可用之前,能用来对照STR分型的可用资本极其有限。ATCC和DSMZ细胞库网站,和CLIMA(细胞系份子审定整合数据库)供应了一些信息,最少两种系列的STR分型数据已宣布。现在,最有效的资本之一是Amanda Capes-Davis 和Ian Freshney收集的毛病审定细胞系清单,那正在欧洲细胞培养物珍藏所(ECACC)网站上也可检察。所有的科研工作者皆应对比那一清单去查对他们正在运用的细胞系称号。

交互式数据库

有人发起竖立一个旨在开辟可用STR分型数据的数据库,这些数据可作为人类细胞系审定的数据。交互式数据库任何人皆可进入,但只要数据库管理员才气对数据停止修正或增补。这个数据库不只供应DNA分型,借能许可实验室将他们的细胞系STR分型数据取数据库里的细胞系数据相比较,如许便于确保实行数据的可靠性。

通用尺度是构成一个好的数据库的必备条件,运用细胞审定的尺度能够建立起一个由每个有肯定STR分型的单一细胞系构成的交互式数据库,并为STR分型检测和剖析供应必备条件。尺度制订委员会的成员将会取NCBI合作开辟交互式数据库所需求的前提,数据库由NCBI保护。数据库最后只包罗科研人员常用的并生存正在大型细胞库的500个已证明的细胞系。

每个细胞系正在被提交至数据库之前都邑肯定其STR分型。比对STR分型数据最有用的数据库会由一组常见的符号物构成。但是,其实不是所有的数据都是收集雷同的STR位点或是用同一代的测序仪器获得的。针对雷同的STR符号运用不消引物组合是法医和人身份审定中的老例,美国的联邦调查局结合DNA索引体系(CODIS)就是接纳13个中心STR位点组合去录入数据的。为了能保持进入CODIS的数据之间的整合,各实验室必需运用CODIS承认的STR分型试剂盒和仪器,而且严厉根据质量保证尺度去操纵。CODIS承认的试剂盒已阅历了大量的考证研讨,包孕旨在注释运用差别引物组合时泛起STR分型差异的一致性研讨。雷同的顺序会是细胞STR分型所必须的。

将来

从增添的数据可信性、只需很少的工夫和用度,和研讨被毛病审定的细胞系的所破费的精神来看,细胞系STR分型审定将会正在科学研究中发生严重影响。细胞系的准确审定正在研发基于细胞下的医学产物起到至关重要的感化,它能制止将人体细胞袒露于毛病审定细胞中的风险。只管这类毛病审定大部分能够经由过程遵照量控步伐而制止,比方准确符号、正在消费基于细胞的医学产物时接纳跟踪企图,然则当用来证明一个来源于预期供体的细胞产物和它被故意天与其它供体细胞混淆时,应用可明白审定细胞和构造的尺度要领将会供应平安保障。这个问题关于个体化医疗和运用基于干细胞的手艺(包孕引诱多能干细胞)非常重要。

没有一个单一的要领可供应所有的信息去审定一个人类细胞系。STR分型是这一时期的最好代表,因而,跟着新信息的可用,STR分型尺度将会络续天革新。背任何人开放的交互式、可征采的数据库将会大大减低毛病审定细胞的使用率。基金部门和期刊也被勉励接纳对运用毛病审定细胞“整容忍”的政策并要求作者供应证据以支撑其运用的为准确的细胞系。

 

文献泉源Nat Rev Cancer, 2010. 10(6): p. 441-8.

 

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